Punkty kontrolne (checkpoints) w cyklu komórkowym
 

Streszczenie: Komórka jest nieustannie narażona na czynniki środowiskowe uszkadzające DNA i hamujące replikację DNA. Mechanizmem obronnym jest bardzo skomplikowana sieć dróg sygnalizacyjnych, zapewniająca skoordynowane uruchomienie procesów naprawy DNA i zatrzymanie przechodzenia komórki przez cykl komórkowy. Zapobiega to powieleniu uszkodzeń w procesie replikacji a także przekazaniu uszkodzeń komórkom potomnym.
Obecnie uważa się, że uszkodzenia DNA są rozpoznawane przez białka czujnikowe(Rad9, Rad1 i Hus1), co zapoczątkowuje sygnał alarmowy, przenoszony na przekaźniki, mające charakter kinaz typu PI3-K. Kinazy te (ATM, ATR) fosforylują białka efektorowe. Zależnie od rodzaju uszkodzeń i kontekstu komórkowego drogi sygnalizacyjne mogą powodować:
- rekrutację składników układów naprawy DNA do miejsc uszkodzonych,
- aktywację apoptozy,
- hamowanie transkrypcji,
- aktywację układów kontrolujących przechodzenie komórki przez określone punkty cyklu komórkowego.
Pierwszym z nich jest granica faz G1/S. W większości komórek uszkodzenie DNA powoduje fosforylację białek Tp53 i mdm2, co prowadzi do zwiększenia stabilności Tp53, jego tetrameryzacji i działania w charakterze czynnika transkrypcyjnego. Wśród genów, których transkrypcja zostaje pobudzona, jest gen kodujący białko p21/Waf1/Cip1 (CDKN1), inhibitor kinaz cyklinozależnych, kluczowy dla zahamowania wejścia komórki w fazę S.
Jeżeli komórka w momencie uszkodzenia znajduje się w fazie S, ważnym efektorem, modyfikowanym przez Atm jest nibryna (Nbs1), stanowiąca część kompleksu Mre11-Rad 50-Nbs1 działającego w naprawie pęknięć podwójnoniciowych. Mutacja tego białka powoduje, że pomimo uszkodzenia DNA, replikacja DNA postępuje i komórka przechodzi przez fazę S bez opóźnienia. Innymi efektorami są kinaza Chk2  i Brca1, białko o wielu funkcjach, często zmutowane w raku piersi.

Kolejny punkt kontrolny zlokalizowany jest w fazie G2. Najważniejszym efektorem jest kinaza Chk1, aktywowana przez Atm lub Atr w sposób swoisty dla typu uszkodzenia. Chk1 fosforyluje i inaktywuje fosfatazę Cdc25. Dzięki temu nie następuje aktywacja  kinazy p34/Cdc2, niezbędnej do wejścia komórki w mitozę. Równolegle, Tp53 hamuje transkrypcję genów kodujących Cdc2 i cyklinę B1, wzmacniając blok w fazie G2.

Niezbędne do zatrzymania komórki w punktach kontrolnych są także niektóre białka czujnikowe. Przytoczone przykłady ilustrują przeplatanie się funkcji niektórych białek w drogach naprawy DNA i regulacji cyklu komórkowego, jak również wskazują, że komórka dysponuje zapasowymi mechanizmami zatrzymywania w cyklu komórkowym, co jest podstawą komórkowego "bezpieczeństwa i higieny pracy". Inhibitory przeciwdziałające tym mechanizmom uczulają na czynniki uszkadzające i sprzyjają wystąpieniu niestabilności genetycznej, istotnemu czynnikowi w procesie nowotworzenia.

Słowa kluczowe: -

Mechanizmy kontrolujące przebieg i polaryszację mitozy

Streszczenie: -

Słowa kluczowe: -

Proteoliza regulatorów cyklu komórkowego

Streszczenie: W odpowiedzi na różne zewnętrzne i wewnętrzne bodźce stabilność, a zatem ilość, licznych białek regulatorowych podlega w komórkach eukariotycznych "dynamicznej" kontroli, w wyniku precyzyjnej proteolizy. Na ogół białka mające ulec degradacji są w specyficzny sposób wyznakowywane  przez skompleksowanie z ubikwityną, małym (76 AA) powszechnie występującym białkiem globularnym. W kaskadowej, zachodzącej przy udziale ATP ubikwitynacji białek uczestniczą co najmniej trzy enzymy: enzym aktywujący ubikwitynę (E1), enzym łączący się z zaktywowaną ubikwityną (E2) i przenoszący ją na białkowy substrat bądź bezpośrednio, bądź też częściej we współdziałaniu z ligazą ubikwitynową (E3). Ligazy ubikwitynowe stanowią kompleksy kilku (kilkunastu?) białek uczestniczących w precyzyjnym rozpoznawaniu i wiązaniu białkowych substratów i ich translokacji do proteasomu 26S, w którym ulegają degradacji do krótkich peptydów. W ostatnich latach "odkrywane" są coraz to nowe białka, którym przypisuje się funkcje ligaz ubikwitynowych, a dzięki poznaniu struktury i działania  poszczególnych podjednostek staje się możliwe wysuwanie wniosków co do ich homologii w określonych ligazach.

Degradacja większości białek biorących udział w kontroli przebiegu kolejnych faz cyklu komórkowego następuje przede wszystkim w proteasomie 26S. W szczególności dotyczy to cyklin, białkowych inhibitorów kinaz cyklinozależnych (kinaz cdk), białek odpowiedzialnych za rozpoczęcie syntezy DNA, czy też za precyzyjną segregację chromatyd podczas mitozy, a także białek kodowanych przez liczne geny supresorowe i  protoonkogeny, których działanie jest również niezmiernie istotne dla prawidłowego przebiegu cyklu komórkowego.

Ostatni etap ubikwitynacji białek bezpośrednio regulujących przebieg cyklu komórkowego przeprowadzają dwa wieloskładnikowe kompleksy ligaz ubikwitynowych - SCF ( Skp1-Cullin-Fbp) i APC/C ( Anaphase-Promoting-Complex-Cyclosome).

Ligaza SCF działa od połowy fazy G1 poprzez fazę S do połowy fazy G2. W komórkach ludzkich ubikwitynuje ona cykliny fazy g! (cykliny D i E) i białkowe inhibitory kinaz cyklinozależnych (przede wszystkim p27, p21), a także czynnik transkrypcyjny E2F-1 regulujący ekspresję genów kodujących białka konieczne do rozpoczęcia w komórkach syntezy DNA czy też białko Cdc6 (DNA replication factor) wiążące się z miejscem rozpoczęcia transkrypcji. Podstawowymi podjednostkami ligazy SCF są: białko Skp1, kullina (pomost, na którym dochodzi do współdziałania poszczególnych podjednostek), jedno z białek z motywem F-box   odpowiedzialne za rozpoznanie i związanie białka mającego ulec ubikwitacji oraz białko Rbx1/Hit 1/Roc 1 charakteryzujące się obecnością motywu RING-finger i pośredniczące w interakcji kulliny z enzymem E2. Większość białkowych substratów ligazy SCF przed ubikwitynacją jest fosforylowana przez różne kinazy.

Ligaza APC/C aktywna jest od połowy fazy G2, w mitozie i na początku fazy G1. Dołącza ona ubikwitynę przede wszystkim do cyklin mitotycznych (cyklin A i B, podjednostek regulatorowych kinaz cdk1 i cdk2 działających podczas mitozy), do tzw. sekuryn, białek będących inhibitorami rozdziału chromatyd i anafazy, do własnych białek regulatorowych (np. Cdc20), do kinazy Polo/dc5 fosforylującej między innymi fosfatazę Cdc25 oraz podjednostki APC, a także do białka Ase wiążącego się z mikrotubulami wrzeciona mitotycznego czy też gemininy regulującej rozpoczęcie syntezy DNA w fazie S przez hamowanie formowania kompleksu prereplikacyjnego (pre-RC). Stałymi składnikami kompleksu APC/C (złożonego z kilkunastu białek) są białka APC@ i APC11, homologiczne z kulliną oraz białkiem Rbx1/Roc1 w omawianej już ligazie SCF. Białko APC2 jest jednostką podstawową, do której dołączają się inne podjednostki, białko APC11 (z motywem RING-finger) pośredniczy zaś, jak się sądzi, w interakcjach z odpowiednim enzymem E2.

Regulacja funkcjonowania ligazy APC następuje przede wszystkim przez dołączanie do kompleksu określonych podjednostek regulatorowych - białka Cdc20/Fizzy lub białka Cdh1/Hct1/Fizzy-related, uczestniczących, podobnie jak białka z motywem F-box, w rozpoznawaniu i wiązaniu białkowych substratów. Ufosforylowanie zarówno kompleksu APC/C, jak i podjednostek regulatorowych jest istotne dla działania ligazy APC/C. Fosforylacji dokonują kinazy cdk aktywne w mitozie, kinazy Polo, a także kinaza A, przy czym  fosforylacja może zarówno aktywować, jak i hamować działanie ligazy APC/C. Co więcej, ligaza APC/C pozostaje również pod wpływem białek punktu kontrolnego wrzeciona mitotycznego, które są odpowiedzialne za  precyzyjną kontrolę prawidłowości rozdziału chromatyd, przebiegu anafazy i zakończenia mitozy. Białka z rodzin MAD i BUB  tworzą, po uaktywnieniu punktu kontrolnego wrzeciona, przejściowe kompleksy z białkiem Cdc20, regulatorem aktywności ligazy APC/C, inaktywując w ten sposób jej działanie i zatrzymując komórki w metafazie. W ostatnich latach poznano także mechanizm odpowiedzialny za inaktywację ligazy APC/C w interfazie. Zidentyfikowano bowiem białko Emi1/Rca1 działające jako inhibitor ligazy APC/C, którego syntezę reguluje czynnik transkrypcyjny E2F, a degradację poprzedza ubikwitynacja przeprowadzana przez ligazę SCF.

 Białka będące substratami ligazy APC/C charakteryzuje na ogół obecność tzw. boksu destrukcyjnego (D-box), sekwencji aminokwasowej opisanej po raz pierwszy w cyklinach mitotycznych, niezbędnej do rozpoznania substratu przez ligazę i odpowiedni enzym E2. Mutacje w boksie destrukcyjnym lub też brak tej sekwencji aminokwasowej  wywołują  stabilizację białek i zatrzymanie procesów, w których uczestniczą. Wydaje się także, że sekwencja KEN występująca w niektórych białkach może być również konieczna do ich rozpoznania i ubikwitynacji przez ligazę APC/C skompleksowaną z białkiem regulatorowym Cdh1.
Ostatnio wykazano, że ligazą ubikwitynową jest także białko Chfr działające w punkcie kontrolnym występującym w profazie podziału mitotycznego i monitorujące kondensację chromosomów i ruch centrosomów ku biegunom komórki. Charakteryzuje je obecność domeny FHA (Forkhead-Associated) i motywu  RING-finger, znajdowanego w białkach Rbx1/Roc1 i APC11 omawianych wcześniej ligaz. Ligaza Chfr katalizuje in vitro swoją własną ubikwitynację, a przede wszystkim ubikwitynuje i skierowuje na drogę proteolizy kinazę Polo1 (Plk1), której udział w regulacji cyklu staje się coraz bardziej doceniany i zrozumiały. Jest ona bowiem w znacznym stopniu odpowiedzialna za odpowiedni stan ufosforylowania, a  tym samym aktywności, fosfatazy Cdc25, aktywującej kinazy cdk i kinazy wee, która je hamuje. Rezultatem obniżonego poziomu kinazy Plk1 jest opóźnienie aktywacji fosfatazy Cdc25 i inaktywacji kinazy wee, czego efektem są zakłócenia procesów przebiegających z udziałem kinaz cdk przed rozpoczęciem metafazy. Należy jednakże pamiętać, że oprócz kinazy Plk1 i inne kinazy białkowe fosforylują powyższe enzymy. Zarówno fosfataza Cdc25, jak i kinaza wee są degradowane w układzie ubikwityna-proteasom, a ich ubikwitynację przeprowadza prawdopodobnie ligaza SCF.

Motyw RING-finger występuje także w białku MDM2, które jest ligazą ubikwitynującą białko supresorowe p53, degradowane następnie w proteasomie 26S. Wewnątrzkomórkowy poziom MDM2 jest ściśle regulowany na poziomie transkrypcji, a także bardzo efektywnie poprzez  kompleksowanie z różnymi białkami komórkowymi i wirusowymi. Mutanty p53, a także pokrewne p53 białka p73 i p63, nie są rozpoznawane i ubikwitynowane przez ligazę MDM2. O możliwości utworzenia kompleksu p53-MDM2 decyduje wewnątrzkomórkowa  lokalizacja tych białek oraz fosforylacja w każdym z nich określonych reszt aminokwasowych. Drugim, ostatnio zidentyfikowanym substratem ligazy MDM2, okazał się receptor androgenowy. Jego ubikwitynacja przez ligazę MDM2 w znacznym stopniu zależy od aktywności kinazy Akt. Chociaż ani p53, ani receptor androgenowy nie biorą bezpośredniego udziału w poszczególnych etapach cyklu, to jednak ich precyzyjnie  kontrolowana proteoliza  jest bardzo istotna ze względu na wpływ tych czynników transkrypcyjnych na ekspresję wielu białek bezpośrednio zaangażowanych w  regulację przebiegu cyklu komórkowego, a także apoptozy.

Degradowane w proteasomie 26S są  również błonowe receptory (o aktywności kinaz tyrozynowych) wielu czynników wzrostu, takich jak np. FGF, PDGF czy też HGF. Ich ubikwitynacji dokonuje ligaza Cbl, oddziałująca poprzez motyw RING-finger  z odpowiednim białkiem E2 przenoszącym ubikwitynę.
Poza wymienionymi białkami również wiele innych białek istotnych dla przebiegu cyklu jest degradowanych proteolitycznie i to nie tylko przy udziale układu ubikwityna-proteasom. Przykładem takich białek są c-Myc i pRb, degradowane zarówno w proteasomie (nieznana dotąd ligaza ubikwitynowa), jak i przez zależną od jonów wapnia proteazę cysteinową  - kalpainę (c-Myc) oraz kaspazy (pRb).

W powyższym opracowaniu skoncentrowano się na omówieniu ubikwitynacji białek regulujących cykl komórkowy. Należy zdawać sobie sprawę, że równie istotny, chociaż mniej poznany jest proces ich deubikwitynacji  w sytuacjach nieprawidłowego wyznakowania ubikwityną. Przeprowadzają go liczne (>90 dotąd poznanych) proteazy cysteinowe, których rola w regulacji cyklu komórkowego zaczyna obecnie być doceniana.

Jak pokazano, w proteolizie białkowych regulatorów cyklu uczestniczy bardzo wiele białek. Należy sobie zdawać sprawę, że również ich wewnątrzkomórkowy poziom może zmieniać się pod wpływem różnych czynników, czego efektem może być bądź niepożądana w danym momencie stabilizacja białka regulatorowego, bądź też jego przyspieszony rozkład. Jak już obecnie wiadomo, zaburzenia ubikwitynacji i deubikwitynacji białek leżą u podłoża wielu schorzeń, zwłaszcza proliferacyjnych, autoimmunologicznych i neurologicznych. Dotychczasowy stan wiedzy na temat przebiegu podstawowych szlaków ubikwitynacji i degradacji białek sprawia, że w ostatnich latach mogły się już rozpocząć badania ukierunkowane na farmakologiczną kontrolę proteolizy białek regulatorowych cyklu.

Słowa kluczowe: -
 

Wpływ mitotycznej fosforylacji na oddziaływanie białek HMGN z chromatyną oraz ich transport do jądra komórkowego

Streszczenie:Białka HMGN (high mobility group N) tworzą rodzinę białek jądrowych, które wiążą się z nukleosomami, kształtują strukturę chromatyny, wzmacniają transkrypcję oraz replikację z matrycy chromatynowej. Dwie cząsteczki białka HMGN wiążą się z nukleosomem niezależnie od sekwencji DNA. Wiązanie to stabilizuje nukleosom jednocześnie nie usztywniając struktur chromatyny wyższego rzędu. Białka HMGN stanowią element architektury chromatyny, wspomagają rozluźnianie włókien chromatynowych obniżając hamujący wpływ histonów na proces transkrypcji.
W trakcie podziału mitotycznego podstawowe  procesy zachodzące w komórce to kondensacja chromatyny oraz zahamowanie aktywności transkrypcyjnej. Oba zjawiska  są związane z usunięciem wielu czynników transkrypcyjnych, a także białek strukturalnych z obszaru chromatyny. Zmiana sposobu oddziaływania białek z chromatyną w trakcie mitozy często zależna jest od miejsca i stopnia ich ufosforylowania.
Podczas mitozy białka HMGN podlegają masowej fosforylacji, modyfikacja ta dotyczy konserwowanej ewolucyjnie domeny decydującej o wiązaniu się tych białek z nukleosomem  (NBD-nucleosomal binding domain). Wykazano, że fosforylacja domeny NBD hamuje wiązanie białek HMGN z nukleosomem, a także negatywnie wpływa na ich transport do jądra komórkowego po odtworzeniu błony jądrowej w późnej telofazie. W wyniku fosforylacji następuje obniżenie powinowactwa HMGN do nukleosomu, co jest spowodowane zmianą ładunku białka na negatywny, natomiast hamowanie transportu do jądra jest związane z obecnością grupy fosforanowej, która decyduje o specyficznym oddziaływaniu białek HMGN z niektórymi izoformami białka 14-3-3. Wykazano, że istnieje ścisły związek między oddziaływaniem HMGN z chromatyną, a ich transportem do jądra komórkowego. Mitotyczna fosforylacja jednocześnie wpływa na oba te procesy regulując w ten sposób dostępność białek HMGN dla chromatyny.

Słowa kluczowe: -

Mejoza

Streszczenie: -

Słowa kluczowe: -