Plastyczność nieembrionalnych komórek macierzystych: fakt czy artefakt?

Streszczenie: Plastyczność nieembrionalnych komorek macierzystych jest jednym z najbardziej kontrowersyjnych zagadnień współczesnej biologii i medycyny doświadczalnej. Koncepcja, że komórki macierzyste ukierunkowane tkankowo mogą się odróżnicowywać, dając początek komórkom macierzystym innych  tkanek i narządów, stwarza z jednej strony nadzieję na opracowanie nowych strategii terapeutycznych w medycynie regeracyjnej wykorzystujących te właśnie komórki do leczenia, z drugiej zas jest waznym argumentem przyczyniającym się do spowolnienia badań nad wykorzystaniem w podobnym celu komorek embrionalnych. W pracy pokrótce przedstawiony zostanie własny pogląd autorów na zjawisko plastyczności nieembrionalnych komórek macierzystych. Przedstawione zostaną wyniki badań własnych, pokazujących możliwość krążenia komórek macierzystych w ustroju, współzawodniczaących o wspólne nisze w tkankach. Fakt, że w tkankach obwodowych mogą znajdować  się heterogenne populacje wczesnych macierzystych komórek ukierunkowanych dla różnych tkanek i narzaądów tłumaczy szereg artefaktów w badaniach, gdzie pokazano tzw. plastyczność nieembrionalnych komórek macierzystych. Komórki ukierunkowane tkankowo, pomimo że nie mają zdolności transróżnicowania w inne komórki macierzyste, są jednak ważnym źródłem dla procesów regeneracyjnych (np. układu krwiotwórczego, naskórka, wątroby). Dlatego też optymalizacja ich izolacji i opracowanie metod ekspansji ex vivo w hodowlach jest istotnym wyzwaniem medycyny doświadczalnej.

Słowa kluczowe: LIF, HGF, SDF-1, plastyczność, fuzja komórkowa, izolacja chemotaktyczna, regeneracja.
 

Próba izolacji ludzkich komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Streszczenie: Zespół nasz wykazał, że wczesne komórki mięśni szkieletowych (komórki satelitarne) mają na powierzchni ekspresję receptora CXCR4. Stwierdziliśmy również, że izolowane z mięśni szkieletowych za pomocą kolejnych pasaży i sortera komórkowego komórki mające ekspresję CXCR4 tworzą w hodowlach in vitro charakterystyczne miotuby. Uważamy więc, że komórki te mogą zostać wykorzystane w procesach regeneracji tkanki mięśniowej.  Prowadzone w chwili obecnej badania mają na celu optymalizację metody ich izolacji do celów klinicznych.

Słowa kluczowe: komórki satelitarne, izolacja, plastyczność komórkowa, CXCR4, SDF-1, regeneracja.
 

Komórki progenitorowe śródbłonków: pochodzenie, charakterystyka i perspektywy wykorzystania w terapii

Streszczenie: Śródbłonki naczyniowe oraz komórki krwi wywodzą się ze wspólnej komórki mezodermalnej – hemangioblastu. Potwierdzeniem bliskiego pokrewieństwa obu linii komórkowych są wspólne antygeny, występujące na wczesnych etapach różnicowania. Komórki prekursorowe dla śródbłonków, definiowane jako CD34+ CD133+ Flk-1+, dają się różnicować w hodowli in vitro do komórek śródbłonkowych. Progenitory komórek śródbłonkowych, izolowane ze szpiku kostnego, krwi pępowinowej oraz z krwi obwodowej, in vivo mogą wbudowywać się w ścianę uszkodzonego naczynia i podejmować funkcje śródbłonka. Opanowanie technik izolacji i propagacji tych komórek stwarza potencjalną możliwość ich wykorzystania w terapii schorzeń wymagających reparacji naczyń krwionośnych, zwłaszcza zawału mięśnia sercowego. Bliższe poznanie mechanizmów rządzących neoangiogenezą być może pozwoli również na kontrolę wzrostu nowotworów.

Słowa kluczowe: progenitorowe komórki śródbłonków, CD34, VEGF-R2, waskulogeneza, angiogeneza, choroba niedokrwienna, nowotwory.

Postępy w metodach izolacji i namnażania komórek  macierzystych naskórka ludzkiego

Streszczenie: Skóra ludzka jest organem bogatym w komórki macierzyste, które w hodowli in vitro tworzą tzw. holoklony. Komórki te wykazują wysoki poziom ekspresji ??1- i ?6- integryny, białka  p63, Delta1, a także ?-kateniny. Wczesne keratynocyty budzą  wiele zainteresowania w sferze badań zarówno podstawowych, jak i klinicznych, z uwagi na ich potencjalną możliwość wykorzystania w leczeniu oparzeń i troficznych owrzodzeń. Mimo że namnażane z małych biopsji ex vivo  keratynocyty są  z powodzeniem wykorzystywane w klinice, nasza wiedza o mechanizmach regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych skóry jest bardzo ograniczona. Celem prowadzonych przez nas badań jest uzyskanie czystej populacji macierzystych komórek naskórka i ich maksymalnie wydajne namnażanie w celu wykorzystania klinicznego. Stwierdziliśmy, że receptor c-kit jest bardzo przydatny w oczyszczaniu keratynocytów z frakcji melanocytów w hodowli pierwotnej. Rozpoczęliśmy również próby fenotypowania wczesnych keratynocytów wykorzystując wybrane przeciwciała (przeciwko CXCR1, CD44H, c-met,??3-,5-,6-integrynom, FAS) w celu zidentyfikowania markerów powierzchniowych, które mogłyby być wykorzystane do izolacji macierzystych komórek skóry. Jako markera służącego izolacji wczesnych komórek naskórka formujących in vitro holoklony użyliśmy przeciwciała przeciwko ?1-integrynie jednocześnie barwiąc komórki rodaminą 123.  Zaobserwowaliśmy, że komórki najsłabiej barwiące się rodaminą 123 i jednocześnie wykazujące najwyższą  ekspresję ??1-integryny są wysoce wzbogacone w komórki formujące w hodowli tzw. holokony. Wykorzystując tę subpopulację komórek testowaliśmy następnie wpływ wybranych czynników wzrostu  i cytokin na ich proliferację i różnicowanie. Próbowaliśmy jednocześnie skorelować dane z hodowli in vitro z aktywacją wybranych ścieżek transdukcji sygnału regulujących proliferację i przeżywalność komórek.

Słowa kluczowe: naskórek, komórka macierzysta, namnażanie  in vitro.

Ocena udziału komórek macierzystych człowieka w regeneracji mięśnia szkieletowego – badania na modelu mysim

Streszczenie: Zdolność myszy SCID do przyjmowania przeszczepów ksengenicznch, pozwala na badanie udziału ludzkich komórek macierzystych  regeneracji tkanek. Regeneracja mięśni szkieletowych jest dobrym modelem do badań nad zaangażowaniem komórek macierzystych w ten proces. Regeneracja mięśni szkieletowych zależy od obecności komórek satelitowych (komórek prekursorowych mięśni). Oprócz nich w regeneracji mogą uczestniczyć komórki macierzyste pochodzące z innych tkanek. Celem projektu jest zbadanie, jaki może być udział komórek macierzystych w regeneracji  w układzie ksenogenicznym. Opisano przebieg regeneracji mięśni myszy SCID oraz pokazano wstępne wyniki podawania im ludzkich komórek macierzystych z krwi pępowinowej.

Słowa kluczowe: regeneracja, komórki macierzyste, mięśnie szkieletowe.

Ocena dojrzewania komórek progenitorowych megakariocytów w hodowli in vitro komórek macierzystych hematopoezy
 

Streszczenie: Możliwość izolacji komórek macierzystych i ich hodowli in vitro w kierunku określonych komórek progenitorowych hematopoezy przeszczepianych następnie pacjentom, stwarza szansę nowej generacji terapii komórkowej w leczeniu wielu defektów układu krwiotwórczego, w tym m.in. małopłytkowości. Do chwili obecnej nie opracowano procedury hodowli in vitro, która zapewniałaby uzyskanie wystarczającej dla celów klinicznych liczby prekursorów megakariopoezy. Celem pracy jest opracowanie warunków ekspansji  ex vivo komórek progenitorowych megakariocytów. Otrzymane wyniki umożliwiły wstępną   optymalizację warunków hodowli. Charakterystyka fenotypowa i morfologiczna potwierdziły różnicowanie komórek inicjujących hodowlę w kierunku komórek progenitorowych megakariocytów. Korelacja aktywności ?1,6-fukozylotransferazy (6FucT) z ilością komórek o fenotypie CD41a+  hodowli wskazuje, że aktywność tego enzymu może stanowić nowy, kolejny wskaźnik różnjcowania i dojrzewania komórek CD34+ w kierunku megakariocytów.

Słowa kluczowe: komórki progenitorowe megakariocytów, ekspansji  ex vivo,??1,6-fukozylotransferaza.
 

Komórki macierzyste jako narzędzie terapeutyczne w schorzeniach neurologicznych

Streszczenie: Choroby neurodegeneracyjne są heterogenną grupą schorzeń o zróżnicowanym obrazie klinicznym i odmiennym podłożu, których cechą wspólną jest dysfunkcja lub zanik szczególnie wrażliwych populacji komórek nerwowych. Występowanie selektywnego zaniku komórek nerwowych pozwala na zastosowanie jednolitej strategii terapeutycznej polegającej na zastępowaniu ubytków nowymi komórkami, zdolnymi podjąć funkcje utraconych komórek. Od 20 lat trwają próby przywrócenia prawidłowych funkcji za pomocą transplantacji komórek nerwowych w chorobach neurodegeneracyjnych, zwłaszcza w chorobie Parkinsona i Huntingtona. Próby kliniczne koncentrowały się dotychczas na transplantacji fragmentów embrionalnej tkanki nerwowej, zawierających częściowo zróżnicowane neuroblasty dopaminergiczne, które w mózgu gospodarza mają zdolność różnicowania w dojrzałe neurony. Niedawne odkrycie, że niedojrzałe, wielopotencjalne, progenitorowe komórki neuronalne mogą być izolowane z centralnego układu nerwowego zarówno rozwijającego się zarodka, jak i organizmu dojrzałego oraz utrzymywane i namnażane w hodowli, stwarza dodatkowe możliwości potencjalnych zastosowań w zastępowaniu ubytków neuronalnych i terapii genowej. Obecność w szpiku kostnym i krwi pępowinowej komórek macierzystych/prekursorowych, które mają zdolność do samopowielania się i różnicowania in vitro w komórki nerwowe, otwiera możliwość wykorzystania nieembrionalnych komórek macierzystych z tych źródeł w terapii chorób neurodegeneracyjnych i urazów mózgu. Przedmiotem tego opracowania jest krytyczna analiza dostępnych w literaturze przykładów pozyskiwania i wykorzystania komórek macierzystych/prekursorowych w terapii schorzeń neurologicznych oraz rozważania na temat kluczowych problemów, które muszą być rozwiązane, aby komórki  macierzyste stały się użytecznym narzędziem terapeutycznym.

Słowa kluczowe: neurodegeneracja, ischemia, komórki macierzyste, progenitory neuronalne, endogenne komórki macierzyste.

Optymalizacja techniki pozyskiwania komórek krwiotwórczych od heparynizowanych dawców narządów (HDN)

Streszczenie: Ważnym źródłem organów unaczynionych i tkanek do celów transplantologicznych są heparynizowani dawcy narządów (HDN). Stale rosnąca liczba pobrań narządowych oraz potencjalna łatwość, z jaką można pozyskiwać od HDN komórki szpiku wymogła potrzebę opracowania efektywnej metody pobierania od nich i zabezpieczania  KKM, pod kątem ich wykorzystania do celów transplantologicznych. Dotychczas opisywane metody pobierania szpiku kostnego od dawców narządów, którzy nie otrzymywali antykoagulantu przed pozyskaniem szpiku, były czasochłonne, technicznie skomplikowane i co się z tym wiąże drogie. Fakt rutynowego podawania heparyny dawcom narządów sprawia, że szpik w ich jamach szpikowych pozostaje płynny. Można go więc pozyskiwać drogą prostej aspiracji. Przedmiotem badań w prezentowanej pracy były niektóre aspekty optymalizacji pozyskiwania i przechowywania komórek od HDN, w tym wybór odpowiedniego czynnika przeciwkrzepliwego. Powinien on być dobrany w ten sposób, aby do minimum ograniczyć ewentualne niekorzystne działanie wobec komórek krwiotwórczych. Najlepszym antykoagulantem do pobierania i krótkoterminowego przechowywania szpiku okazał się być roztwór heparyny. Poddano następnie ocenie media stosowane do przechowywania komórek żywych. Wykazano, iż optymalną pożywką w medium do pobierania szpiku od HDN jest RPMI. Stwierdzono ponadto większą przeżywalność komórek krwiotwórczych przechowywanych w pojemnikach z dostępem powietrza, w porównaniu z tymi, które umieszczono w warunkach próżni. Obecność czystego tlenu jest natomiast toksyczna dla komórek. Komórki szpiku pobieranego od HDN powinny być transportowane w pojemnikach zawierających powietrze. Oceniając wpływ dojrzałych elementów morfotycznych krwi w zawiesinie na przeżywalność przechowywanych komórek szpiku kostnego stwierdzono, że obecność erytrocytów i granulocytów wykazuje korzystny wpływ na przeżywalność komórek progenitorowych szpiku od HDN podczas przechowywania w 4°C. Opisane wyniki mogą w niedalekiej przyszłości przyczynić się do podęcia szerokiej inicjatywy organizowania banków ludzkich komórek hematopoetycznych pozyskiwanych od HDN. Utworzenie takich ośrodków w znaczącym stopniu mogłoby poszerzyć dostępność komórek krwiotwórczych wykorzystywanych do celów klinicznych.

Słowa kluczowe:komórki macierzyste krwiotwórcze (KKM)  i ukierunkowane,  heparynizowani dawcy narządów (HDN).
 

Badania nad pochodzeniem miocytów błony wewnętrznej w przeszczepie aorty allogenicznej u szczura

Streszczenie: Rozplem błony wewnętrznej stanowi podstawową zmianę w patologicznej przebudowie ściany naczynia. Badania z zastosowaniem modelu przeszczepienia aorty allogenicznej wskazują, że znaczna część miocytów powstałej błony wewnętrznej wywodzi się z komórek macierzystych pochodzących od biorcy. Prowadzone doświadczenia mają na celu określenie mechanizmów kontrolujących migrację prekursorów komórek mięśni gładkich do ściany naczynia.

Słowa kluczowe: komórki macierzyste, miocyty ściany naczynia, przebudowa ściany naczynia.
 

Optymalizacja metod izolacji i ekspansji komórek CD 34+ krwi pępowinowej

Streszczenie: Celem pracy była optymalizacja ekspansji komórek linii monocytowo-makrofagowej na potencjalne potrzeby eksperymentalne i terapeutyczne. Porównano różne frakcje komórek poddawanych ekspansji (mniej lub bardziej wzbogacone w komórki CD34+), optymalny skład czynników wzrostowych i cytokin oraz surowicę wchodzącą w skład medium hodowlanego.

Słowa kluczowe: Słowa kluczowe: ekspansja ex vivo, komórki CD34+, krew pępowinowa, monocyty.
 

Augmentacja tkanki kostnej szczęk przy wykorzystaniu autologicznego szpiku, krwiotwórczych komórek macierzystych oraz koncentratu krwinek płytkowych: analiza fraktalna obrazów RTG

Streszczenie: Problem augmentacji tkanki kostnej w obrębie szczęk jest szczególnie istotny w aspekcie rehabilitacji implantologiczno-protetycznej, przy braku wystarczającej ilości tkanki kostnej niezbędnej do umocowania implantów stomatologicznych. W ostatnich latach zaproponowano metodologię inżynierii tkankowej pozwalającą na odbudowę pionową i poziomą wyrostka zębodołowego i części zębodołowej szczęk. W pracy wykorzystano trzymiesięczne obserwacje po przeszczepieniach: 1) autologicznego szpiku, 2) frakcji izolowanych ze szpiku autologicznego populacji komórek jednojądrzastych z określoną liczbą komórek macierzystych (CD 34) oraz 3) masy płytkowej (PRP, platelet rich plasma). Przeszczepy zakładano w łoża kostne po usuniętych torbielach szczęk. Nośnikiem dla wymienionych przeszczepów były fragmenty wołowej odbiałczonej kości Bio-Oss (Geistlich). Dla analizy porównawczej efektu augmentacyjnego wymienionych przeszczepów zastosowano nieinwazyjną analizę matematyczną obrazów rtg okolicy augmentowanej versus okolicy kontrolnej-kontralateralnej. Dzięki zastosowaniu algorytmów analizy fraktalnej możliwe stało się porównanie stopnia samoodtwarzania i podobieństwa nowopowstających struktur w stosunku do struktur już istniejących. Ilość takich „samoreplikacji” daje się ocenić obiektywnie stosując analizę fraktalną. Analiza fraktalna wykazała wyraźne różnice w odbudowie architektury beleczek kostnych odtwarzanych przy użyciu poszczególnych przeszczepów, w porównaniu  z prawidłową kością okolicy kontralateralnej. Otrzymane wyniki analizy wskazują, iż stopień złożoności i samopowtarzalności odtwarzanej struktury nowopowstających beleczek kostnych jest najbardziej zbliżony do struktury kości prawidłowej, dla struktury odtworzonej po zastosowaniu masy płytkowej. Największe różnice między odtwarzaną strukturą a strukturą prawidłową wystąpiły przy odbudowie po zastosowaniu szpiku autologicznego, mniejsze różnice stwierdzono po przeszczepieniu komórek jednojądrzastych szpiku, zawierających określoną populację komórek macierzystych CD 34. Wydaje się,  iż w procesie sterowanej regeneracji kości (GBR, guided bone regeneration) istotna jest obecność aktywnych czynników wzrostowych, głównie PDGF i innych, np. BMPs, TGFs, IGF obecnych w płytkach krwi i uwalnianych w krótkim czasie. Aktywacja komórek macierzystych wymaga prawdopodobnie dłuższego czasu dla syntezy i wydzielania tkankowych stymulatorów, czynników parakrynowych, a także – być może –  obecności innych komórek.

Słowa kluczowe:  komórki macierzyste, przeszczepianie szpiku, masa płytkowa PRP, augmentacja kości szczęk, Bio-Oss.
 

Badanie potencjalnej przydatności klinicznej komórek macierzystych uzyskiwanych z krwi pępowinowej
 

Streszczenie: Krew pępowinowa zawiera komórki macierzyste zdolne do repopulacji układu krwiotwórczego i wytwarzania dojrzałych komórek należących do innych tkanek. Podczas gdy krwiotwórcze komórki macierzyste są stosunkowo dobrze scharakteryzowane, to obecność innych (niekrwiotwórczych) budzi wciąż wiele kontrowersji. Jakkolwiek istnieją doniesienia o obecności w krwi pępowinowej odpowiedników mezenchymalnych komórek macierzystych dorosłych, to niektórzy autorzy negują ich istnienie, a inna hipoteza zakłada, że wytwarzane tkanki (nerwowa, kostna, mięśniowa itp.) mogą powstawać jako efekt tzw. plastyczności krwiotwórczej komórki macierzystej. W badaniach własnych zidentyfikowano subpopulację komórek hodowanych jako przylegające do plastyku, zdolnych do wytwarzania co najmniej kilku rodzajów komórek nerwowych. Nie wykazano zdolności transdyferencjacji populacji komórek krwiotwórczych (CD34+, CD45+, nieprzylegające in vitro) w kierunku komórek nerwowych, ani prekursorów komórek nerwowych (CD34–, CD45–, przylegające do plastyku) w kierunku różnicowania w linie krwiotworzenia. Autorzy sugerują, że obecność komórek prekursorowych dla innych tkanek  niż krwiotwórcza  wynika z obecności w krwi pępowinowej odrębnych populacji komórek macierzystych, a nie z efektu plastyczności komórek krwiotwórczych.

Słowa kluczowe: krew pępowinowa, komórka macierzysta, plastyczność komórek macierzystych.
 

Wstępna ocena możliwości wykorzystania krwiotwórczych komórek macierzystych pozyskanych z różnych dawców krwi pępowinowej do jednoczesnego przeszczepienia u biorców dorosłych
 

Streszczenie: Podstawową wadą krwi pępowinowej jako źródła komórek do przeszczepienia, jest niewielka liczba komórek, zwykle poniżej 1 miliarda, co umożliwia wykonanie zabiegu jedynie u dzieci poniżej 30 kg, podczas gdy większość biorców ma większą masę ciała. Stąd pomysł jednoczesnego wykorzystania kilku jednostek krwi pępowinowej, które łącznie mają zapewnić dostateczną liczbę komórek do przeszczepienia dorosłemu biorcy. Najważniejsze jest to, że komórki odpornościowe obecne we krwi pępowinowej, jako komórki młode nie powinny być zdolne do wzajemnej reakcji przeciwko sobie. Takie reakcje są największym zagrożeniem powodzenia pomysłu i dlatego w pierwszej kolejności zbadaliśmy, czy wspólna hodowla komórek krwiotwórczych z dwóch różnych jednostek krwi pępowinowej wiąże się z ich interakcją wpływającą na liczbę generowanych kolonii krwiotwórczych. Badania takie nie wykazały obecności różnic, jeśli chodzi o wartości średnie, ale obserwowano również wyniki przeciwstawne, tj. zarówno zahamowanie, jak i stymulację w poszczególnych kombinacjach. Wykonaliśmy też próbę kliniczną u dorosłego mężczyzny z ostrą białaczką szpikową bez remisji, któremu przeszczepiliśmy komórki z dwóch różnych jednostek krwi pępowinowej. Uzyskaliśmy udokumentowane wszczepienie jednej spośród tych dwóch jednostek i normalizację liczby granulocytów. Ogółem wyniki te sugerują, że badana metoda lecznicza rokuje na przyszłe rutynowe zastosowanie u biorców, którzy nie mają ani spokrewnionego, ani niespokrewnionego dawcy szpiku.

Słowa kluczowe: krew łożyskowa, przeszczepienie szpiku, hematopoeza.