Zielone białko fluorescencyjne GFP – struktura i właściwości

Streszczenie: W ostatnich 10 latach zielone białko fluorescencyjne GFP (Green Fluorescent Protein) ze stułbiopława Aequorea victoria znalazło liczne zastosowania w biologii komórki i biologii molekularnej. Jest szczególne użyteczne ze względu na stabilność struktury trzeciorzędowej i fakt, że jego chromofor powstaje w wyniku autokatalitycznej cyklizacji aminokwasów, do czego nie jest wymagany udział żadnych kofaktorów z wyjątkiem cząsteczek tlenu. W pracy tej przedstawiono najważniejsze strukturalne i fotochemiczne właściwości białka, jak również omówiono mutacje przyspieszające proces fałdowania białka i dojrzewania chromoforu, a także zmieniające właściwości spektralne GFP.

Słowa kluczowe:  GFP, Aequorea victoria, fluorescencja, chromofor białkowy, EGFP.
 

Wykorzystanie zielonego białka fluorescencyjnego GFP w badaniach biologicznych

Streszczenie: Unikatowe właściwości zielonego białka fluorescencyjnego GFP (Green Fluorescent Protein) są głównym powodem powszechnego wykorzystania tego białka w biologii komórki i biologii molekularnej. W pracy tej zostaną zaprezentowane najważniejsze sposoby wykorzystania GFP, takie jak monitorowanie ekspresji genów, badanie dynamiki wewnątrzkomórkowej i oddziaływań międzycząsteczkowych białek oraz tzw. monitorowanie biologiczne. Niedawne odkrycie białek podobnych do GFP rozszerza możliwości znanych technik badawczych, w których wykorzystywane jest to białko, a także daje nadzieje na powstanie nowych, które w najbliższej przyszłości znajdą zastosowanie w kompleksowych eksperymentach cytologicznych i proteomicznych.

Słowa kluczowe: GFP, Aequorea victoria, znacznik fuzyjny, gen reporterowy, FRAP, FRET, wskaźnik pH, czujnik wapniowy, monitorowanie biologiczne.
 

Roślinne  receptory światła  niebieskiego  i  UV-A  pośredniczące w reakcjach fototropicznych,  fotomorfogenezie  i  nastawianiu  zegara  biologicznego

Streszczenie: Krótkofalowa część widma słonecznego, a zwłaszcza światło niebieskie (390–500 nm) i bliski ultrafiolet (320–390 nm) wywierają istotny wpływ na wzrost i rozwój roślin. Badania z zakresu genetyki i biologii molekularnej, prowadzone głównie na modelowej roślinie Arabidopsis thaliana, umożliwiły poznanie trzech klas receptorów światła niebieskiego i UV-A – fototropin, kryptochromów i flawoprotein z rodziny Zeitlupe. Fototropiny (phot1 i phot2) są serynowo/treoninowymi kinazami białkowymi aktywowanymi przez światło, pośredniczącymi w reakcjach fototropicznych, migracji chloroplastów, otwieraniu aparatu szparkowego i krótkotrwałym hamowaniu wzrostu wydłużeniowego pędu. Kryptochromy (Cry1, Cry2 i Cry3) są fotoreceptorami zawierającymi FAD oraz pterynę pośredniczącymi w regulacji wzrostu pędu, rozwoju liści, fotoperiodycznej indukcji kwitnienia i nastawianiu zegara biologicznego. Ztl, Fkf1 i Lkp2 są flawoproteinami tworzącymi nową rodzinę receptorów światła niebieskiego, które łączy obecność domeny PAS/LOV wiążącej FMN, kasety F i sześciokrotnie powtórzonego motywu KELCH. Wyniki najnowszych badań sugerują, że flawoproteiny z rodziny Ztl funkcjonują w nastawianiu zegara biologicznego uczestnicząc w regulowanym przez światło degradowaniu białkowych elementów oscylatora komórkowego.

Słowa kluczowe:  fototropiny, kryptochromy, flawoproteiny z rodziny Zeitlupe, zegar biologiczny.
 

Endotelialna syntaza tlenku azotu Cz. I. Struktura genu i produktu białkowego

Streszczenie: Endotelialna syntaza tlenku azotu (eNOS) jest jednym z trzech enzymów zdolnych do produkcji tlenku azotu (NO). Cząsteczka ta pełni kluczowe funkcje w układzie sercowo-naczyniowym. Gen eNOS składa się z 26 egzonów i zajmuje fragment chromosomu 7 o wielkości 22 kpz. Promotor genu nie zawiera podstawowej sekwencji rozpoznawanej przez kompleks preinicjacyjny polimerazy RNA II, tzw.TATA box. Analiza regionu 5’ ujawniła obecność licznych potencjalnych miejsc wiązania szeregu dodatkowych czynników transkrypcyjnych, co sugeruje możliwość złożonej i dynamicznej regulacji ekspresji. Gen endotelialnej syntazy tlenku azotu charakteryzuje znaczny polimorfizm zarówno w rejonie promotora, jak i w intronach oraz w obrębie sekwencji kodujących. W celu wykazania statystycznie istotnej zależności pomiędzy konkretnymi wariantami allelicznymi a poszczególnymi zaburzeniami układu krążenia przeprowadzono liczne analizy populacyjne. Aktywną formą enzymu jest homodimer. W obrębie poszczególnych monomerów wyróżnia się następujące domeny: C-końcową domenę reduktazy wykazującą znaczną homologię sekwencji aminokwasów z reduktazą cytochromu P-450, małą domenę odpowiedzialną za wiązanie kalmoduliny, domenę oksygenazy oraz N-końcowy fragment będący miejscem mirystylacji i palmitylacji. Enzym zawiera stosunkowo silnie związane kofaktory: FAD, FMN, tetrahydrobiopterynę (BH4) oraz ugrupowanie hemowe. FAD i FMN umożliwiają przepływ elektronów między NADPH a hemem, natomiast rola BH4 nie została ostatecznie sprecyzowana. Aktywność eNOS jest bezwzględnie zależna od obecności kompleksu Ca2+/kalmodulina, który wiążąc się z enzymem znosi inhibicyjne działanie insertu zlokalizowanego w obszarze wiążącym FMN. Postuluje się, że bezpośrednim produktem dwuetapowej reakcji utleniania argininy jest tlenek azotu oraz cytrulina. Źródłem elektronów jest NADPH. Szczegółowy mechanizm reakcji jest nieznany. Pomimo zaawansowanych badań, niektóre z istotnych strukturalnych i funkcjonalnych cech eNOS wciąż pozostają zagadką.

Słowa kluczowe: tlenek azotu, endotelialna syntaza tlenku azotu, kalmodulina, jony wapnia.
 

Endotelialna syntaza tlenku azotu Cz. II. Funkcja biologiczna

Streszczenie: Zaburzenia ekspresji i aktywności eNOS łączą się z takimi jednostkami chorobowymi, jak: miażdżyca, choroba wieńcowa, hipercholesterolemia czy nadciśnienie tętnicze. Po raz pierwszy eNOS została zidentyfikowana w komórkach śródbłonka żył i tętnic; bardziej szczegółowe badania wykazały obecność tego enzymu w miocytach, płytkach krwi, neuronach oraz w komórkach Leydiga i Sertolego. Endotelialna syntaza tlenku azotu gromadzi się w specyficznych miejscach inwaginacji błony komórkowej. Postuluje się, że zagłębienia błony komórkowej stanowią centralne miejsca (tzw. mikrodomeny) w transdukcji sygnałów docierających do komórki z zewnątrz. Endotelialna syntaza tlenku azotu w formie nieaktywnej ściśle oddziałuje z kaweoliną-1, białkiem należącym do stosunkowo dużej rodziny białek transbłonowych. Głównym receptorem dla tlenku azotu, bez względu na źródło i charakter tkanki, w obrębie której powstaje, jest rozpuszczalna cyklaza guanylowa. Wynikiem aktywacji cyklazy jest wzrost poziomu cGMP koniecznego do aktywacji kinazy białkowej G (PKG). Ze względu na niezwykle szeroką gamę substratów PKG, aktywacja eNOS prowadzi do zróżnicowanej odpowiedzi, zależnej od rodzaju komórki. W obrębie śródbłonka, tlenek azotu pełni kluczową rolę w regulacji lokalnego ciśnienia krwi oraz hamuje agregację i adhezję płytek krwi, natomiast w mięśniu sercowym moduluje aktywność skurczową miocytów. Wykazano, że funkcjonalna eNOS jest niezbędna w procesie angiogenezy i przebudowy naczyń krwionośnych. Ze względu na wolnorodnikowy charakter NO, którego nadmierny poziom stanowi niebezpieczeństwo dla otaczających komórek, aktywność eNOS podlega ścisłej i skomplikowanej regulacji. Najbardziej podstawowym elementem tej kontroli jest aktywacja białka uwarunkowana związaniem kompleksu Ca²⁺/kalmodulina. Dodatkowe elementy regulacji to fosforylacja i depalmitylacja enzymu oraz asocjacja z białkiem szoku termicznego Hsp90. Pomimo uznania eNOS za enzym konstytutywny, na przestrzeni ostatnich kilku lat udowodniono, że ekspresja genu podlega silnym wahaniom w odpowiedzi na czynniki wzrostu, hormony, cytokiny i czynniki fizyczne. Dotychczas przeprowadzone doświadczenia nie pozwalają na sformułowanie ostatecznych wniosków nad proponowaną rolą endotelialnej syntazy tlenku azotu w licznych schorzeniach układu krwionośnego.

Słowa kluczowe: tlenek azotu, endotelialna syntaza tlenku azotu, cykliczny GMP, kinaza białkowa G, angiogeneza, choroby sercowo-naczyniowe.
 

Morfologia i funkcja mitochondriów plemnika a męska płodność.
Część I. Prawidłowa morfologia i funkcja wstawki plemnika
 

Streszczenie: Mitochondria plemników są strukturami unikalnymi i nieco odmiennymi od mitochondriów somatycznych. Przechodzą one szereg morfologicznych, biochemicznych i molekularnych zmian związanych z ekspresją specyficznych białek strukturalnych i enzymatycznych, będących markerami ich dojrzewania podczas spermatogenezy. Należą do nich między innymi gonadalny cytochrom c_T, LDH-C₄, oksydaza sulfhydrylowa, proteaza LON i hsp60. Aktywina A wydzielana przez komórki Sertoliego, podczas spermiogenezy indukuje morfologiczne przemiany mitochondriów spermatyd, prowadzące do powstania skondensowanej struktury tych organelli. Natomiast białko spergen-1 wydaje się odpowiedzialne za agregację i adhezję mitochondriów wokół formującej się witki wydłużającej się spermatydy. Dojrzałe mitochondria mają kształt wydłużony i zakrzywiony (półksiężycowaty), wykazują strukturę skondensowaną, z dużą ilością ciasno upakowanych grzebieni i charakterystycznymi przestrzeniami w ich obrębie. Każde mitochondrium otoczone jest unikalną białkową torebką, zawierającą strukturalne białka siarczkowe i selenowe (SMCP) oraz enzymatyczne (PHGPx) o charakterze antyoksydacyjnym. Powierzchnia mitochondriów plemników wykazuje zróżnicowanie strukturalne – specyficzne strukturalne specjalizacje (domeny) – zaangażowane w łączenie się przylegających do siebie mitochondriów. Umożliwiają one stabilne i helikalne połączenie się tych organelli swoimi końcami, jak i powierzchniami bocznymi. Połączone ze sobą mitochondria tworzą osłonkę mitochondrialną, która od strony wewnętrznej przytwierdzona jest do obwodowych włókien gęstych za pomocą siateczki należącej do cytoszkieletu wstawki plemnika. Specyficzna molekularna budowa białek mitochondrialnych i wzajemne połączenie mitochondriów czyni osłonkę mitochondrialną oporną na działanie czynników fizyko-chemicznych i sprawia, że funkcjonuje ona jak jedno organellum, dostarczające ATP do ruchu plemników.

Słowa kluczowe: plemniki, mitochondria, białka mitochondrialne, spermiogeneza.
 

Morfologia i funkcja mitochondriów plemnika a męska płodność.
Część  II.Zaburzenia morfologiczno-funkcjonalne mitochondriów wstawki plemnika

Streszczenie: Zaburzenia morfologiczno-funkcjonalne mitochondriów wstawki plemnika, które są coraz częściej przyczyną niepłodności męskiej (astenoteratozoospermii) można identyfikować stosując precyzyjną diagnostykę mitochondriów wstawki plemnika. Obejmuje ona: 1)  skryningowy test cytochemiczny na mitochondrialne oksydoreduktazy/NADH, 2) cytofluorometryczną ocenę mitochondrialnego potencjału błonowy oraz  badania: 3) fluorescencyjne z zastosowaniem sond mitochondrialnych, 4) mikroskopowo-elektronowe, 5) biochemiczne ujawniające zaburzenia aktywności enzymów łańcucha oddechowego i LDH-C₄, 6) immunocytochemiczne w celu wykrycia ubikwitynowanych mitochondriów plemników i zmniejszonej ekspresji białek tworzących keratynową torebkę mitochondrialną i 7) genetyczne wykrywające mutacje mitochondrialnego genomu. Wiele funkcjonalnych i morfologicznych defektów osłonki mitochondrialnej plemnika  wynika z zaburzeń morfogenezy jego wstawki podczas spermiogenezy.  Defekty te mogą być związane z apoptozą spermatyd, z zaburzeniami genetycznymi ich genomu jądrowego (t haplotyp) lub mitochondrialnego, bądź też mogą powstać w najądrzu. Zmiany mitochondrialne obniżają ruchliwość plemników i przez to ich zdolność do zapłodnienia komórki jajowej. Ponadto, w niektórych przypadkach uzyskania nawet koncepcji (in vivo i in vitro), mogą uniemożliwiać własną eliminację (ubikwitynacja mitochondriów) w zapłodnionej komórce jajowej. Może być to przyczyną spontanicznych przedimplantacyjnych poronień, niekiedy w idiopatycznej niepłodności. Zwrócono uwagę na poznawcze znaczenie diagnostyki mitochondriów plemnika umożliwiającej wykrycie przyczyn astenozoospermii oraz prognostyczne pozwalające przewidzieć szansę na uzyskanie zapłodnienia, zwłaszcza przy zastosowaniu technik wspomaganego rozrodu.

Słowa kluczowe:  plemniki, mitochondria, mitochondrialny DNA, astenoteratozoospermia..
 

Rola receptorów Toll-podobnych w odporności

Streszczenie: Receptory Toll należą do rodziny receptorów o znacznym konserwatyzmie ewolucyjnym. Odgrywają one ważną rolę w aktywacji odporności wrodzonejod owadów aż do ptaków. Po raz pierwszy zostały wykryte i scharakteryzowane u muszki owocowej (Drosophila melanogaster), gdzie biorą udział w embriogenezie i w odporności przeciw patogenom. Wykryto też homologiczne receptory u ssaków, w tym u człowieka, które nazwano receptorami Toll-podobnymi (TLRs; Toll-Like Receptors). Podobnie jak u muszki owocowej, TLRs ssaków zawierają w części zewnątrzkomórkowej domenę z licznymi powtórzeniami leucynowymi (LRR; Leucine Rich Repeats), domenę przezbłonową, a także domenę cytoplazmatyczną homologiczną z domeną cytoplazmatyczną receptora typu I interleukiny 1 (IL-1RI). TLRs występują przede wszystkim na monocytach, makrofagach, granulocytach, ale też na limfocytach, komórkach nabłonkowych i śródbłonku. Znane są także formy rozpuszczalne tych receptorów znajdywane w płynach wydzielniczych. Obecnie znanych jest 10 rodzajów ludzkich TLRs. Częściowo poznane są też ich ligandy, które pochodzą głównie z drobnoustrojów (egzogenne), ale też od gospodarza (endogenne). TLRs rozpoznają, w przypadku ligandów egzogennych, tzw. wzory molekularne związane z patogenami (PAMPs; Pathogen Associated Molecular Patterns), a ligandami endogennymi są dla nich białka powstające w czasie uszkodzenia komórek i tkanek. Przyłączenie ligandu do TLR powoduje szybką aktywację odporności wrodzonej, inicjację procesu zapalnego w wyniku indukcji syntezy cytokin prozapalnych, zwiększoną ekspresję antygenów głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I i II, cząsteczek kostymulujących na komórkach prezentujących antygen (APC; Antigen Presenting Cells), a co za tym idzie lepszą prezentację antygenu i w efekcie odpowiednią aktywację odporności nabytej. Dokładne poznanie mechanizmów efektorowych i transdukcji sygnałów w wyniku przyłączenia ligandu do TLR może mieć duże znaczenie w poznaniu mechanizmów rozpoznawania swój-obcy, aktywacji procesu zapalnego, a także znaczenie odporności wrodzonej dla aktywacji, swoistości i typu odporności nabytej.

Słowa kluczowe:  receptory Toll-podobne (TLRs), odporność wrodzona, wzory molekularne związane z patogenami (PAMPs), bioinformatyka.
 

Mózgowe naczynia kapilarne. Ultrastrukturalne wykładniki procesów angiogenezy

Streszczenie: W artykule opisano cechy morfologiczne naczyń kapilarnych w okolicy barierowej i bezbarierowej mózgu. Przedstawiono również na poziomie ultrastrukturalnym przykłady nowoformowanych naczyń, które powstają według dwóch różnych mechanizmów oraz z udziałem macierzystych komórek śródbłonkowych. Obserwacje morfologiczne znajdują potwierdzenie w badaniach immunocytochemicznych.

Słowa kluczowe: naczynia kapilarne,  ultrastruktura, angiogeneza, macierzyste komórki śródbłonkowe.
 

Kanały aparatu importu białka do mitochondriów

Streszczenie: Podstawową rolę w przebiegu importu białka do mitochondriów odgrywają kanały umożliwiające translokację białek przez błony mitochondrialne, jak i ich wbudowywanie w obszar tych błon. W zewnętrznej błonie mitochondrialnej zlokalizowany jest kanał importowy kompleksu TOM (the translocase of the outer membrane) oraz kanał uczestniczący w fałdowaniu białek o strukturze beczułki b kompleksu TOB (the topogenesis of mitochondrial outer membrane ?-barrel proteins). Z kolei w błonie wewnętrznej zlokalizowane są dwa kanały o odrębnej specyficzności substratowej. Funkcjonują one w obrębie kompleksów TIM (the translocase of the inner membrane); TIM23 i TIM22. Nie ulega wątpliwości, że kanały mitochondrialnego aparatu importu białka stanowią istotne punkty kontrolne w przebiegu importu białka do mitochondriów.W związku z tym stanowić mogą one ważny cel w terapii ludzkich chorób pochodzenia mitochondrialnego.

Słowa kluczowe:   kanał  kompleksu TOM, kanały kompleksów TIM,  kanał VDAC, kanał kompleksu TOB, import białka
 

Mechanizmy oporności  komórek białaczkowych z udziałem
onkogennych kinaz tyrozynowych

Streszczenie: Chromosom Filadelfia (Ph) jest wynikiem translokacji chromosomalnej prowadzącej do transformacji nowotworowej komórek krwiotwórczych. Powodem jest aktywność onkogennej kinazy tyrozynowej BCR/ABL powstającej z fuzji genów w wyniku przeniesienia fragmentu chromosomu 9 do chromosomu 22 [t(9;22)]. Istnieje cała rodzina fuzyjnych kinaz tyrozynowych (FTKs) spokrewnionych z BCR/ABL, takich jak: TEL/ABL, TEL/JAK2, TEL/TRKC(L), TEL/PDGFâR oraz NPM/ALK, które indukują zarówno ostre, jak i przewlekłe białaczki szpikowe oraz chłoniaki. FTKs aktywują szlaki wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnału stymulujące komórki do podziałów, chronią je przed apoptozą i aktywują mechanizmy prowadzące do lekooporności. Różne FTKs mają zdolność aktywacji czynników transkrypcyjnych STAT. STAT5 jest niezbędny do zależnej od FTKs regulacji RAD51 w mechanizmie naprawy przez rekombinację homologiczną (HRR). Ponadto podczas terapii lekowej komórki zmienione przez FTKs wykazują opóźnienie cyklu komórkowego w punkcie kontrolnym G2/M. Odnajduje się w nich również podwyższony poziom białek antyapoptotycznych. Najprawdopodobniej współdziałanie wszystkich tych procesów leży u podstaw zjawiska lekoopornosci i stanowi główny problem skutecznej terapii białaczek.

Słowa kluczowe: BCR/ABL, fuzyjne kinazy tyrozynowe, lekooporność, białaczki.
 

Molekularne i fizjologiczne podstawy funkcjonowania roślinnego zegara okołodobowego

Streszczenie: Zegar okołodobowy stanowi jedno z najbardziej fascynujących przystosowań do życia na Ziemi. Dzięki wewnętrznemu zegarowi organizmy mogą nie tylko reagować na periodyczne następstwo dnia i nocy, ale również mierzyć długość dnia, będącą wskaźnikiem pór roku. Endogenny zegar generuje rytmy około 24-godzinne. Nastawianie zegara odbywa się głównie poprzez zmiany warunków świetlnych i temperatury o świcie i zmierzchu. Mechanizm odpowiedzialny za generowanie rytmów okołodobowych składa się z trzech głównych elementów: drogi wejścia czynników środowiskowych synchronizujących działanie zegara, wewnętrznego oscylatora, drogi wyjścia w postaci rytmiki procesów fizjologicznych i rozwojowych kontrolowanych przez zegar. Światło stanowi zasadniczy sygnał nastawiający zegar. Wykazano ścisły związek pomiędzy fotoreceptorami i elementami zegara biologicznego u różnych modeli badawczych. U roślin obie rodziny cząsteczek fotoreceptorowych, tj. fitochromów i kryptochromów, biorą udział w transdukcji sygnału świetlnego do oscylatora. Rodzina białek ZTL, FKF1 i LKP2 (zawierających domenę LOV, powtórzony motyw kelch oraz kasetę F-box), jak i nowo zidentyfikowane białka jądrowe GI i ELF3 także biorą udział w przekazywaniu sygnału świetlnego do zegara. Molekularne badania dotyczące wewnętrznego oscylatora u różnych organizmów (np. Arabidopsis thaliana, Neurospora crassa, Drosophila melanogaster) wskazują, że działa on na zasadzie pętli sprzężenia zwrotnego, złożonej z elementów pozytywnych i negatywnych. Białka kodowane przez geny zegara działają jako elementy negatywne, które hamują swoją własną ekspresję poprzez blokowanie czynników transkrypcyjnych, będących elementami pozytywnymi. U roślin najbardziej prawdopodobne elementy oscylatora to: białko TOC1 lub APRR1 – komponent dwuskładnikowego systemu regulacji odpowiedzi (ang. response regulator), oraz dwa białkowe czynniki transkrypcyjne wyposażone w domenę MYB - LHY i CCA1. Wykazano, iż roślinny zegar okołodobowy sprawuje kontrolę nad wieloma różnorodnymi procesami fizjologicznymi i rozwojowymi roślin m.in. wzrost komórek, otwieranie aparatów szparkowych, ruchy liści oraz kwitnienie.

Słowa kluczowe:Arabidopsis thaliana, fotoreceptory, okołodobowe rytmy, oscylator, roślinny zegar okołodobowy.