Postępy Biologii Komórki, tom 32, 2005, supl. 23

Streszczenie: Przedstawiony artykul ma na celu zaprezentowanie aktualnego stanu wiedzy na temat metod funkcjonalnej charakterystyki genów. Postep w analizie ekspresji genów w komórkach czy calych tkankach jest bezsporny i przyczynia sie do coraz lepszego zrozumienia roli poszczególnych genów. Zastosowanie tradycyjnych metod analizy funkcjonalnej genów, takich jak: metoda przewidywania przez homologie, metoda inaktywacji i zwiekszonej ekspresji genów, coraz czesciej zastepowana jest przez silnie wspomagane narzedziami bioinformatycznymi analizy mikromacierzy i chipów DNA. W praktyczny sposób wiedza na temat funkcji i zmian ekspresji genów wykorzystywana jest w diagnostyce medycznej, przemysle farmaceutycznym oraz biotechnologii roslin i zwierzat.

Epigenetyczna kontrola rozwoju roślin przez białka grupy polycomb i tritorax

Streszczenie: Program ekspresji genów podczas rozwoju zwierząt i roślin jest kontrolowany przez mechanizmy epigenetyczne. Kontrola ta może odbywać się przez metylację/demetylację DNA lub metylację/demetylację specyficznych lizyn w histonach H3 i H4. Grupa białek Polycomb (PcG) jest odpowiedzialna za utrzymanie genów w stanie represji, zaś grupa białek tritorax (trxG) utrzymuje geny w stanie aktywnym. Metylacja lizyn 9. i 27. w histonie H3 oraz metylacja lizyny 20. w histonie H4 powoduje wyciszenie genów. Metylotransferazy histonów (HMTazy) są białkami przynależnymi do PcG. W aktywnej transkrypcyjnie chromatynie ma miejsce metylacja lizyn 4. i 36. w histonie H3, a także lizyn 5. i 8. w histonie H4. Te HMTazy oraz acetylazy są obecne wśród białek trxG.Najwcześniej białka PcG zostały odkryte u Drosophila melanogaster jako czynniki niezbędne dla kontroli właściwej ekspresji genów homeotycznych. Białka trxG zapewniają u tego organizmu aktywność genów homeotycznych koniecznych dla rozwoju w poszczególnych segmentach. Kompleksy PcG i trxG stanowią ogólny mechanizm o charakterze konserwatywnym – od owadów do ssaków i roślin. Zarówno w królestwie zwierząt, jak i roślin białka PcG i trxG działają na takie same geny docelowe, głównie geny homeotyczne. Wiedza na temat roli PcG i trxG u roślin jest poparta głównie badaniami przeprowadzonymi na modelowym gatunku – Arabidopsis thaliana. PcG u Arabidopsis zawiera szereg homologów tych białek obecnych u Drosophila i ssaków (p. tab. 1) oraz homologów białka HP1 zwierząt zwanego LHP1 (podobnego do HP1). U zwierząt działanie PcG oparte jest na wielobiałkowych kompleksach PRC1 i PRC2 (ang. Polycomb Repressive Complexes). PRC2 zawiera HMTazę dla H3K27me3. U roślin istnieją kompleksy podobne do PRC2 (PRC2-like). Sugeruje się, że u roślin LHP1 funkcjonuje podobnie jak PRC1, tzn. uczestniczy w remodelingu chromatyny.U Arabidopsis rozwój systemu rozmnażania generatywnego podlega regulacji przez kompleksy podobne do PRC2, które kontrolują rozwój gametofitu żeńskiego (woreczek zalążkowy), bielma i zarodka. Istnieje pogląd, w myśl którego dwa rodzaje kompleksów podobnych do PRC2 regulują odmienne geny docelowe, ale główną grupą genów docelowych dla PcG są kwiatowe geny homeotyczne.Tritorax1 Arabidopsis (ATX1) jest bliskim homologiem białka TRX u myszy. Domena SET w ATX przypuszczalnie wykazuje słabą aktywność HMTazy dla H3K4me. Aktywność HMTaz dla histonów H3K4me3 i H3K36me3 wykazują inne białka z kompleksu trxG. Genami docelowymi dla trxG są kwiatowe geny homeotyczne oraz gen FLC, uczestniczący w procesie wernalizacji (p. tab. 3). Metylacja DNA i modyfikacje histonów powodujące wyciszenie genów odpowiadają za ekspresję genów w zależności od pochodzenia rodzicielskiego (tzw. parent-of-origin effect). Wśród jedenastu zbadanych genów u Arabidopsis thaliana i Zea mays, tylko dwa były wyciszane przez białka z PcG – jeden matczyny i jeden ojcowski; w pięciu genach dezaktywacja ojcowskich alleli była spowodowana przez metylację DNA, zaś mechanizm wyciszenia trzech innych ojcowskich alleli jest nieznany (p. tab. 3). Mimo że badania systemów PcG i trxG u roślin w ciągu minionego dziesięciolecia były bardzo owocne, podobnie jak i liczne uzyskane na materiale zwierzęcym, nie jest rozwiązane podstawowe zagadnienie, a mianowicie jaki mechanizm molekularny PcG zapobiega transkrypcji. Nie jest dotąd jasne, czy represyjna metylacja histonów rdzeniowych H3 i H4 jest jedyną funkcją białek PcG, czy też za wyciszenie ekspresji genów odpowiedzialne są modyfikacje podstawowych mechanizmów rządzących transkrypcją.

Streszczenie: TILLING (ang. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) i FOX-hunting (ang. Full-length cDNA Over-eXpressing gene hunting system) to nowe metody badawcze, które umożliwiają masową i szybką analizę funkcjonalną genów. Przyspieszenie prac w tym obszarze nauk biologicznych jest konieczne do systematyzowania danych uzyskiwanych w programach sekwencjonowania genomów, genów oraz EST (ang. Expressed Sequence Tag), a także w programach badań zmian ekspresji genów, prowadzonych przy zastosowaniu analizy mikromacierzy DNA. Klasyczne metody badań funkcjonalnych były i są prowadzone drogą „od cechy do genu” (ang. Top-down/ Forward). Najpierw, przy stosowaniu metod mapowania jakościowego lub ilościowego poszukuje się markerów genetycznych silnie sprzężonych z cechą. Kosegregujące z cechą markery nanosi się na mapy fizyczne kontigów klonów bibliotek genomowych w celu wyboru klonu zawierającego poszukiwany gen, co sprawdzane jest w teście komplementacji. Wynik pozytywny tego testu potwierdza przewidziane funkcje biologiczne badanego genu, jednakże brak oczekiwanych zmian fenotypowych w transformantach nie stanowi negacji przyjętych założeń, ze względu na często zachodzące wyciszanie genów. Innym typem rozwiązań w analizie funkcjonalnej genów jest droga „od mutacji do genu” (ang. Botom-up/Reverse), zakładająca wytwarzanie, poszukiwanie oraz analizę mutantów i to właśnie podejście jest wykorzystywane w obydwu omawianych technikach. Technika TILLING, to połączenie tradycyjnej mutagenezy chemicznej z nowoczesną i czułą, techniką identyfikacji mutantów punktowych, SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism), opartą na analizie PCR. Metoda ta polega na namnażaniu mieszaniny równych ilości DNA poszczególnych mutantów w reakcji PCR, a następnie na trawieniu produktów endonukleazą Cel1 rozpoznającą niesparowane zasady w podwójnej nici DNA. Ważnym i trudnym etapem wstępnym jest uzyskanie odpowiednio dużej i wystarczająco wysyconej populacji mutantów, co zależy zarówno od czynnika chemicznego, jak i od modyfikowanego genomu. Drugim krytycznym krokiem jest przygotowanie DNA matrycowego, które jest kolekcjonowane w 96-dołkowych mikropłytkach. Do pojedynczej reakcji PCR przygotowuje się mieszaniny DNA zbierając do 8 probówek DNA z poszczególnych rzędów dołków, a potem (do 12 probówek) DNA z dołków kolejnych kolumn, tak że materiał z jednej mikropłytki można przeanalizować w 20 (8 + 12), a nie 96 reakcjach. Analizę DNA wielu płytek można dodatkowo usprawniać zbierając DNA z tych samych dołków różnych płytek. W celu identyfikacji mutantów każdy z produktów reakcji PCR jest poddawany denaturacji, a następnie renaturacji, co powoduje powstawanie heterodupleksów z niesparowanymi zasadami w miejscu mutacji. Trawienie tego DNA endonukleazą Cel1 specyficzną do niedopasowanych zasad umożliwia ich identyfikację po rozdziale elektroforetycznym na żelu sekwencyjnym. W metodzie TILLING identyfikacja mutantów jest szybsza niż klasyczna metoda identyfikacji mutantów SNP, gdyż: i/ zamiast koszto- i czasochłonnego sekwencjonowania wykorzystuje się enzym restrykcyjny trawiący renaturowane produkty PCR w miejscach niedopasowanych nukleotydów i standardową elektroforezę DNA; ii/ reakcja PCR prowadzona jest na skalę masową, na matrycy DNA będącej mieszaniną kilku/kilkunastu próbek. Technika FOX-hunting, to nowa metoda nadekspresji genów roślinnych, która umożliwia szybkie wyodrębnianie i sekwencjonowanie równolegle z analizą funkcjonalną. Jest ona modyfikacją/rozwinięciem metody transformacji rzodkiewnika wektorami binarnymi wprowadzanymi do komórek roślinnych przez A. tumefaciens, przez zamaczanie młodych kwiatostanów w zawiesinie biblioteki binarnej. Wektory binarne stosowane w systemie FOX-hunting zawierają pomiędzy sekwencjami granicznymi: i/ dwa tandemowe powtórzenia wzmacniacza transkrypcji (sekwencji –490 do –90 pz poprzedzającej promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora CaMV); ii/ promotor 35S (sekwencja –90 do –1 pz wirusa CaMV); iii/ sekwencję W – 5' liderowy, nieulegający translacji odcinek RNA wirusa mozaiki tytoniu (TMV), zwiększający efektywność translacji wprowadzanego genu; iv/ kasetę zawierającą gen, którym chcemy transformować A. thaliana w otoczeniu sekwencji starterów (GS4 i GS6) ułatwiających jego identyfikację w mutancie oraz sekwencji rozpoznawanych przez endonukleazę SfiI; v/ terminator transkrypcji genu syntazy nopaliny (nos) z plazmidu Ti oraz vi/ gen selekcyjny odporności na higromycynę. Do konstrukcji biblioteki w wektorze binarnym wykorzystywane są pojedyncze kopie każdego z genów zgromadzonych w bibliotekach cDNA skonstruowanych w wektorach Lambda ZAP i Lambda FLC-1-B. Zalety systemu FOX-hunting, to: i/ mały procent kosupresji genów wskutek stosowania pełnej długości klonów cDNA i znormalizowanych bibliotek w wektorach binarnych; ii/ liczebne ograniczenie ekspresji genów metabolizmu podstawowego (ang. house-keeping genes) w znormalizowanych bibliotekach; iii/ ułatwienia w analizie fenotypowej wynikające z krótkiego cyklu życiowego A. thaliana; iv/ dość łatwa izolacja i sekwencjonowanie genów. Wadą tego systemu jest ograniczenie analizy funkcjonalnej jedynie do genów wykorzystanych do konstrukcji biblioteki w A. tumefaciens. Obydwie techniki, TILLING i FOX-hunting, pozwalają na przyspieszenie analizy genów. Programy je wykorzystujące mogą być również dodatkowym źródłem zróżnicowanego materiału dla hodowli. System TILLING z tej racji, iż został opracowany do badania mutantów indukowanych chemicznie, pozwala na natychmiastowe i bezpośrednie wprowadzanie uzyskanych materiałów do hodowli. System FOX-hunting otwiera głównie perspektywy w analizie funkcjonalnej, generując cenne mutanty, w których obserwuje się nadekspresję genów.

Słowa kluczowe: TILLING, FOX-hunting, analiza funkcjonalna genów, mutageneza

Streszczenie: Rozwój technik biologii molekularnej umożliwił poznanie podstaw wielu chorób genetycznych, w tym chorób warunkowanych delecjami i duplikacjami fragmentów genomowego DNA – CNV (ang. Copy Number Variants), stanowiących około 5,5% opisanych dotychczas patogennych zmian w genomie. Jedną z metod badania delecji i duplikacji fragmentów genomu jest MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), opisana po raz pierwszy w 2002 roku. Jest to technika molekularna oparta na ligacji i PCR, która umożliwia względną ilościową ocenę równocześnie 40–45 różnych sekwencji nukleotydowych w jednej reakcji. W MLPA używane są specyficzne sondy hybrydyzujące do komplementarnych badanych odcinków DNA. Sondy te skonstruowane są z dwóch fragmentów, które po hybrydyzacji do badanego obszaru, ulegają ligacji i służą następnie jako jedna matryca dla polimerazy DNA. Po przeprowadzeniu PCR z użyciem znakowanych starterów następuje ocena ilości produktu zależna bezpośrednio od ilości matrycy, co widoczne jest jako zmiana intensywności fluorescencji podczas rozdziału w elektroforezie kapilarnej w stosunku do prób kontrolnych, które stanowią normę i punkt odniesienia dla prób badanych. Liczne pozycje światowej literatury naukowej są dowodem na użyteczność i dużą skuteczność metody MLPA w diagnostyce mikrodelecji i mikroduplikacji, aneuploidii oraz w badaniach nowotworów zarówno w wykrywaniu delecji i duplikacji krytycznych obszarów, jak i w badaniu poziomu metylacji. Jej niskie koszty, krótki czas analizy, niskie wymagania dotyczące sprzętu oraz możliwość badania wielu sekwencji w jednej reakcji sprawiają, że jest to metoda o dużym potencjale i szerokim zastosowaniu.

Streszczenie: P53 jest wielofunkcyjnym białkiem o masie cząsteczkowej 53 kDa, aktywowanym w odpowiedzi na różnorodne stresy komórkowe. Przyczynia się do zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G₁ oraz do indukcji apoptozy, bierze udział w regulacji transkrypcji genów, w procesie różnicowania się komórek i angiogenezie, zaś do jego najbardziej znanych funkcji należy naprawa uszkodzeń DNA. Niezbędny w sytuacjach stresu komórkowego, mogącego zagrozić integralności genomu, nosi nazwę „strażnika genomu”. Zakażona komórka dąży do uniemożliwienia wirusowi ekspresji genów uruchamiając szlak apoptozy, gdyż jej śmierć może powstrzymać rozprzestrzenianie się zakażenia. W interesie wirusa leży jak najszybsze powielenie genomu i maksymalne odroczenie apoptozy, dąży on również do aktywacji cyklu komórkowego. Różne wirusy w toku koewolucji z organizmem gospodarza wykształciły szereg złożonych mechanizmów modyfikacji komórkowych szlaków biochemicznych zmierzających ku autodestrukcji, w których podstawowym celem wirusa jest p53. W tym artykule dokonano ogólnej charakterystyki p53 zwracając szczególną uwagę na strategie stosowane przez wirusy podczas zakażenia.

Streszczenie: Kwaśne fosfatazy (EC 3.1.3.2) są grupą enzymów katalizujących hydrolizę zróżnicowanych estrów ortofosforanowych. Występują powszechnie w komórkach roślinnych, a także zwierzęcych. Wśród kwaśnych fosfataz wyróżniamy kilka grup enzymów charakteryzujących się zróżnicowaną specyficznością substratową i lokalizacją komórkową. Fosfatazy wykazujące wysoką specyficzność substratową zostały stosunkowo dobrze opisane i ich funkcja w procesach metabolicznych jest znana, natomiast rola niespecyficznych kwaśnych fosfataz nie została w pełni poznana. Ze względu na lokalizację można wyróżnić kwaśne fosfatazy zewnątrzkomórkowe uczestniczące w pozyskiwaniu fosforanu nieorganicznego – Pi z podłoża oraz wewnątrzkomórkowe biorące udział w mobilizacji Pi z puli orga-nicznych związków fosforu w komórkach roślin. Niespecyficzne kwaśne fosfatazy uczestniczą w reakcji roślin na niedobór fosforu, ale także na deficyt wody, zasolenie, czy w odpowiedzi roślin na patogeny. Purpurowe kwaśne fosfatazy, zawierające jony metali w centrum aktywnym, są najlepiej poznane spośród niespecyficznych fosfataz. U roślin ze względu na masę molekularną wyróżniamy dwie grupy tych enzymów: małe (ok. 35 kDa) i duże (ok. 55 kDa) purpurowe kwaśne fosfatazy. Pełnią one istotną rolę w uwalnianiu Pi z trudno dostępnych roślinom organicznych źródeł oraz prawdopodobnie uczestniczą w usuwaniu reaktywnych form tlenu w starzejących się lub poddanych stresowi tkankach. Szczegółowa rola purpurowych fosfataz w komórkach roślinnych jest obecnie intensywnie badana. Fitazy są wysoko specyficznymi fosfatazami, które uczestniczą w hydrolizie trudno ulegającego degradacji kwasu fitynowego (oraz jego soli). Enzymy te biorą udział w udostępnianiu zapasowych form fosforu w kiełkujących nasionach, ale także mogą być wydzielane przez mikroorganizmy i niektóre rośliny do podłoża. Prezentowana praca przedstawia najnowsze doniesienia oraz podsumowuje dotychczasowy stan wiedzy na temat zróżnicowanej roli kwaśnych fosfataz, głównie ich udziału w gospodarce fosforanowej roślin.

Słowa kluczowe: deficyt fosforu, fitazy, purpurowe kwasne fosfatazy, sekrecja

Streszczenie: Rośliny dla prawidłowego wzrostu i rozwoju wymagają określonego stężenia makroelementów i mikroelementów. Jednak w wysokich stężeniach zarówno metale niezbędne, jak i balastowe są bardzo toksyczne dla żywych organizmów. Rośliny, jako organizmy nieprzemieszczające się w trakcie cyklu życiowego, wytworzyły mechanizmy regulujące procesy pobierania, dystrybucji i sekwestracji jonów lub innych substancji. W ostatnich latach w komórkach roślinnych zidentyfikowano i wstępnie scharakteryzowano rozmaite systemy transportowe zaangażowane w aktywne przenoszenie jonów metali przez błony komórkowe. Wyróżniamy wśród nich m.in. integralne białka błonowe z rodziny CaCA (ang. Ca²⁺/Cation Antiporter), transportujące Ca²⁺ lub inne kationy z wykorzystaniem przezbłonowego gradientu H⁺ albo Na⁺. Na podstawie podobieństwa i funkcji, wszystkie białka z rodziny CaCA podzielono na 5 podrodzin: antyportery Na⁺/Ca²⁺ (NCX), zależne od potasu antyportery Na⁺/Ca²⁺ (NCKX i CCX), zidentyfikowane u Prokaryota transportery YRBG i transportery CAX, przy czym najbliżej dotąd scharakteryzowane białka CaCA należą do podrodziny CAX. Białka CAX zidentyfikowano u roślin, grzybów i bakterii i co ciekawe nie znaleziono sekwencji genowych homologicznych do genów CAX u modelowych organizmów zwierzęcych, w tym u człowieka. Początkowo wszystkie roślinne białka CAX zgrupowano w jedną podrodzinę liczącą 11 transporterów (CAX1–11). Później, na podstawie bardziej szczegółowych analiz składu aminokwasowego, podrodzinę podzielono na dwie grupy białek: typowe białka CAX (CAX1–6) i nietypowe białka CAX (CAX7–11), wykazujące duże podobieństwo do antyporterów Na⁺/Ca²⁺ zależnych od potasu. Typowe białka CAX Arabidopsis thaliana i Oryza sativa podzielono dodatkowo na dwie różne podgrupy: IA i IB. Pojedynczy łańcuch polipeptydowy białek CAX złożony jest z ok. 400 aminokwasów i tworzy domeny transbłonowe (7–12) o strukturze a-helisy. Transportery CAX jako podrodzina białek CaCA mają domeny charakterystyczne dla tej rodziny, jak również motywy specyficzne tylko dla swojego typu. Domeny te odgrywają często kluczową rolę w regulacji aktywności transportowej białek warunkując ich funkcję transportową oraz determinują ich specyficzność substratową. W obrębie sekwencji wyróżniono: pętle c-1 i c-2, które działają jak filtr odpowiadający za selekcję i wiązanie kationów, domenę autoinhibitorową, która uczestniczy w regulacji aktywności białek, domenę CaD, domenę manganową, domenę D oraz motyw kwaśnych aminokwasów, które prawdopodobnie determinują specyficzność substratową transporterów. Badania prowadzone w układach heterologicznych, podobnie jak analizy roślinnych mutantów cax dowiodły, że transportery typu CAX stanowią istotny komponent układu utrzymującego homeostazę wapniową w komórkach roślinnych i drożdżowych. Jednakże dalsze analizy funkcjonalne białek CAX pokazały, że są to transportery o szerokim powinowactwie do różnych metali. Wprowadzenie genów CAX, pochodzących od różnych roślin do mutantów drożdżowych pozbawionych swoistych transporterów metali, przywracało mutantom zdolność do transportu Cd²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺ i Mn²⁺, a tym samym oporność na nadmiar tych metali w środowisku. Z czasem okazało się, że funkcje białek tej rodziny są wielorakie i na poziomie całego organizmu determinują pośrednio prawidłowy wzrost i rozwój roślin. Prawdopodobnie biorą one udział nie tylko w utrzymaniu homeostazy metali (Ca, Mn, Ni i Cd), ale również w utrzymaniu szeroko pojętej równowagi jonowej w organizmie roślinnym. Mutanty cax1 akumulowały mniej Zn²⁺ i Mn²⁺, natomiast u podwójnych mutantów cax1/cax3 zaobserwowano istotnie większy poziom PO43–, Mn2+ i Zn2+ w stosunku do roślin dzikich. Wskazuje się również na udział transporterów CAX w odpowiedzi roślin na stres chłodu i stres solny. Poziom transkryptu AtCAX1 wyraźnie wzrastał po traktowaniu roślin temperaturą 4°C, natomiast ekspresja genów AtCAX1-4 była stymulowana w obecności soli w środowisku. Dość liczne badania wskazują także na wzajemne interakcje pomiędzy transporterami CAX oraz oddziaływania tych białek z innymi białkami błonowymi. Profil organowej ekspresji genów CAX analizowany u Arabidopsis thaliana pokazał, że poszczególne geny tej rodziny ulegają zróżnicowanej lub podobnej ekspresji na różnych etapach ontogenezy rośliny. Biotechnologiczne manipulacje z udziałem genów CAX mogą doprowadzić do uzyskania modyfikowanych roślin uprawnych, stanowiących bogate źródło niezbęd-nych pierwiastków w diecie człowieka. Ekspresja genu sCAX1 u ziemniaka, pomidora i marchwi powodowała wzrost zawartości wapnia w jadalnych częściach roślin oraz podwyższoną sekwestrację tego pierwiastka w centralnej wakuoli. Białka CAX mogą być także wykorzystane w procesie tzw. fitoremediacji, czyli oczyszczania gleb z metali ciężkich. Rośliny z podwyższoną ekspresją genów CAX w wyższym stopniu akumulują kadm, mangan i wapń w wakuolach.

Słowa kluczowe: transportery wtórne, bialka CAX, detoksykacja, fitoremediacja, metale ciezkie, heterologiczna ekspresja.

Słowa kluczowe: receptor insuliny, gen INSR, alternatywny splicing, izoformy receptora insuliny, receptory hybrydowe, insulinooporność

Streszczenie: Metale ciężkie zarówno te niezbędne do życia mikroelementy, jak i te niepełniące żadnych fizjologicznych funkcji stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Działalności ludzi doprowadziła do pojawienia się ogromnych ilości tych metali w glebach na całym świecie. Ze względu na wysoką toksyczność metali ciężkich istnieje pilna potrzeba rozwinięcia efektywnych i tanich metod remediacji gleb. Konwencjonalne metody remediacji gleb są mało efektywne i drogie oraz często powodują zniszczenie naturalnych siedlisk. Efektem jest rozwój metod alternatywnych, takich jak fitoremediacja, w której rośliny są wykorzystywane jako organizmy oczyszczające gleby z ksenobiotyków, w tym także metali ciężkich. Istnieje wiele różnorodnych technik fitoremediacyjnych. Do remediacji gleb zanieczyszczonych metalami ciężkimi przydatne mogą być następujące techniki: fitoekstrakcja, fitostabilizacja oraz fitoulatnianie. Fotoekstrakcja polega na usuwaniu zanieczyszczeń z gleby, które są następnie magazynowane w pędach roślin. W przeciwieństwie do fitoekstrakcji, fitostabilizacja nie pozwala na usunięcie zanieczyszczeń z gleby, są one tylko stabilizowane i przez to niedostępne dla innych organizmów. Fitoulatnianie umożliwia biologiczną konwersję metali w formę gazową i ich uwolnienie do atmosfery. Chociaż w naturze istnieją gatunki roślin zdolne do fitoremediacji, to ich wydajność oczyszczania terenów zdegradowanych jest ograniczona. Naturalne fitoremediatory stanowią jednak doskonały model badań komórkowych mechanizmów leżących u podstaw naturalnej odporności na wysokie stężenia metali ciężkich. Wskazanie genów zaangażowanych w te procesy umożliwi uzyskiwanie w przyszłości transgenicznych odmian zdolnych do fitoremediacji dużych zdewasto-wanych terenów. Obecnie najwięcej prób utworzenia takich odmian podejmuje się wykorzystując geny kodujące ligandy wiążące metale ciężkie, białka transportujące jony metali oraz enzymy związane z biologicznym przekształcaniem rtęci w formę gazową. Uzyskiwane wyniki pozostają niejednoznaczne. Jednakże w związku z wzrastającą potrzebą uzyskania taniego i efektywnego sposoby remediacji gleb prace są intensyfikowane i być może w bliskiej przyszłości fitoremediacja stanie się tanim i skutecznym sposobem oczyszczania gleb.

Słowa kluczowe: fitoremediacja, metale ciężkie, inżynieria genetyczna, remediacja środowiska

Streszczenie: Tlenek azotu (NO) jest wolnym rodnikiem, który był obszernie badany jako substancja powodująca zanieczyszczenie powietrza oraz produkt metabolizmu pewnych grup bakterii. Sposoby jego pobierania, metabolizm oraz szkodliwy wpływ na rośliny zostały dobrze poznane. Okazało się jednak, że rośliny nie tylko reagują na zmiany stężenia NO w środowisku, lecz są w stanie samodzielnie go produkować. Zmieniło to sposób myślenia o tlenku azotu, który obecnie uważany jest za cząsteczkę sygnalną odgrywającą doniosłą rolę w szlakach transdukcji sygnałów u roślin, w które zaangażowane są także cykliczne nukleotydy (cAMP, cGMP), nadtlenek wodoru, kwas salicylowy czy jony wapnia. Stężenie NO, jako cząsteczki biologicznie aktywnej, musi podlegać ścisłej regulacji w miejscu jego działania, za co odpowiadają zarówno mechanizmy prowadzące do jego generowania, jak i usuwania. Wiadomo, że NO jest wytwarzany z udziałem syntazy tlenku azotu z L-argininy, z azotynów, w wyniku działania reduktazy azotanowej, jak również w wyniku przemian nieenzymatycznych (reakcje oksydoredukcyjne), jako produkt pośredni w procesie wiązania azotu, oddychania czy denitryfikacji. W proces jego unieczynniania zaangażowanych jest szereg związków, takich jak: rodnik ponadtlenkowy (O2–), glutation, jony metali grup przejściowych oraz niesymbiotyczna hemoglobina. Działanie NO w organizmie rośliny jest wielokierunkowe i zależne od różnych czynników wewnętrznych i środowiskowych. Jego udział został opisany w niektórych procesach morfogenetycznych, takich jak: skracanie fazy spoczynkowej nasion, promowanie procesu kiełkowania i starzenia roślin, hamowanie kwitnienia, programowana śmierć komórki i ksylogeneza, jak również w ruchach aparatów szparkowych. Jednak najlepiej został poznany jego udział w reakcjach odpornościowych na czynniki biotyczne (infekcja patogenu) oraz abiotyczne (susza, zasolenie, wysokie temperatury, naświetlanie światłem UV, metale ciężkie, herbicydy, zranienie). W przeważającej większości czynniki stresowe powodują wzrost stężenia NO, którego zadanie polega na zmniejszaniu szkodliwych skutków działania wolnych rodników oraz reakcji z innymi cząsteczkami sygnalnymi, takimi jak: kwas salicylowy, jony wapnia czy cykliczny GMP. Ponadto stwierdzono jego udział w modulowaniu ekspresji genów zaangażowanych w reakcje stresowe. Celem niniejszego opracowania jest przedstawienie wiadomości dotyczących metabolizmu tlenku azotu w komórkach roślinnych oraz udziału w reakcjach roślin na stres abiotyczny. Ponadto przedstawiono dowody na współdziałanie NO z innymi cząsteczkami sygnalnymi w regulacji zamykania szparek w odpowiedzi roślin na stres dehydratacyjny.

Słowa kluczowe: tlenek azotu, stres abiotyczny, reaktywne formy tlenu, transdukcja sygnału

Streszczenie: Niestabilność genomu jest wynikiem defektów systemów naprawy DNA i leży u podstaw procesu transformacji nowotworowej. Białka BRCA1 i BRCA2, których mutacje zidentyfikowano w raku piersi i jajnika, biorą udział w wielu procesach komórkowych warunkujących zachowanie stabilności genomu. Podstawowym procesem jest naprawa pęknięć dwuniciowych – DSBs (ang. Double Strand Breaks), należących do najgroźniejszych uszkodzeń DNA. Brak sprawnych systemów naprawy pęknięć dwuniciowych DNA może prowadzić do utraty materiału genetycznego lub śmierci komórki. Wydajność naprawy dwuniciowych pęknięć DNA wpływa na integralność genomu. Białka BRCA1 i BRCA2 wchodzą pośrednio lub bezpośrednio w interakcje z białkiem RAD51, będącym homologiem białek RecA Escherichia coli i Rad51 Saccharomyces cerevisiae. Wszystkie trzy białka odgrywają kluczową rolę w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA w procesie rekombinacji homologicznej – HR (ang. Homologous Recombination), wykorzystującym do odtworzenia struktury DNA jego nieuszkodzoną, homologiczną cząsteczkę. Pod wpływem uszkodzenia DNA białka BRCA1, BRCA2 i RAD51, wraz z innymi białkami uczestniczącymi w naprawie przez rekombinację homologiczną, lokalizują się w miejscu uszkodzenia. W inicjacji tego wieloetapowego procesu naprawy DNA bierze udział kompleks MRN, zawierający białka MRE11, RAD50 i NBS1, którego funkcją jest utworzenie jednoniciowego DNA. W przekazaniu sygnału o uszkodzeniu innym białkom zaangażowanym w naprawę DNA, interakcję z kompleksem MRN i modulację aktywności białka RAD51 uczestniczy białko BRCA1. Białko BRCA2 umożliwia wiązanie się białka RAD51 z jednoniciowym DNA w miejscu uszkodzenia i promuje naprawę dwuniciowych pęknięć DNA. Z kolei białko RAD51 tworzy nukleoproteinowy filament, który dokonuje inwazji na nieuszkodzony, homologiczny fragment DNA, w procesie określanym jako wymiana nici z wytworzeniem heterodupleksu.

Słowa kluczowe: BRCA1, BRCA2, RAD51, pęknięcia dwuniciowe DNA, naprawa DNA, rekombinacja homologiczna

Słowa kluczowe: osteoblasty, czynniki transkrypcyjne, Runx2, Osterix, osteoblastogeneza

Streszczenie: Kinaza płytek przylegania – FAK (focal adhesion kinase) należy do grupy niereceptorowych białkowych kinaz tyrozynowych. Występuje w cytoplazmie większości komórek, w tym osteoblastów. W momencie jej aktywacji, związanej z oddziaływaniem integryn z białkami macierzy zew-nątrzkomórkowej, inkorporowana jest do płytek przylegania. Obecność kinazy FAK w tychże strukturach jest ściśle związana z funkcją, jaką odgrywa ona w procesach komórkowych, takich jak: adhezja, migracja czy proliferacja. Komórki z niedoborem FAK wykazują znacznie wolniejszy wzrost oraz zmniejszoną ruchliwość. Kinaza uruchamia szereg różnych ścieżek przekazywania sygnału w komórce, prowadzących m.in. do różnicowania komórek. Regulując aktywność kinaz należących do grupy MAPK (kinazy białkowe aktywowane mitogenami), wpływa na dojrzewanie i różnicowanie komórek w kierunku osteoblastów w warunkach in vitro. Stymuluje pośrednio aktywację genów charakterystycznych dla fenotypu prawidłowych osteoblastów: Runx2 i Osterix. Brak genu kodującego kinazę uniemożliwia różnicowanie komórek w kierunku osteoblastycznym. W niniejszej pracy starano się wykazać rolę, jaką pełni kinaza FAK w biologii komórki, ze szczególnym uwzględnieniem osteoblastów.

Słowa kluczowe: kinaza płytek przylegania (FAK), różnicowanie, migracja, proliferacja, apoptoza, osteoblasty

Streszczenie: Polarny transport auksyn, odbywający się z udziałem białek nośnikowych, jest unikalnym sposobem rozprowadzania auksyny w roślinie umożliwiającym powstawanie w określonych komórkach lub tkankach gradientu stężenia fitohormonu. W transporcie auksyny uczestniczą białka należące do trzech rodzin: nośniki PIN (PIN-formed), pompy PGP/ABCB (P-glycoprotein/ATP binding cassette) i permeazy AUX1/LAX (AUXIN RESISTANT1/LIKE-AUX1). Wyniki dotychczasowych badań potwierdziły, iż pięć, spośród ośmiu białek PIN A. thaliana, funkcjonuje jako nośniki transportujące auksynę z komórki. Białka PGP/ABCB, należące do nadrodziny transporterów z kasetą wiążącą ATP, stanowią drugą grupę transporterów pompujących auksynę z komórki do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Z tej rodziny białek najlepiej w A. thaliana scharakteryzowano transportery PGP1/ABCB1, PGP19/ABCB19 i PGP4/ABCB4. Wyniki najnowszych badań sugerują, że białka PIN i PGP, funkcjonujące jako niezależne transportery eksportujące auksynę samodzielnie, in vivo współdziałają w transporcie fitohormonu. W transporcie auksyny z apoplastu do wnętrza komórki uczestniczy symporter AUX1 oraz trzy jego funkcjonalne analogi LIKE-AUX1. Problemem skupiającym obecnie uwagę wielu badaczy jest niezwykła elastyczność mechanizmów redystrybucji w obrębie komórki białek transportujących auksyny, jawiących się jako kluczowe elementy regulujące polarny transport fitohormonu. Wewnątrzkomórkowa relokalizacja transporterów auksyn, możliwa dzięki konstytutywnemu recyklingowi białek, obejmuje endocytarną internalizację i przeniesienie białek w transporcie pęcherzykowym do endosomu, a następnie ich powrót do błony komórkowej dzięki transportowi egzocytarnemu. Ostatnie badania pokazały, że internalizacja białek PIN odbywa się za pośrednictwem transportu pęcherzykowego zależnego od klatryny. Powrót transporterów z różnych kompartymentów endosomów do błony plazmatycznej lub ich transport do wakuoli litycznych podlega skomplikowanej regulacji, w której pośredniczą małe białka G, kompleksy retromerowe i kinazy białkowe podrodziny AGCVIII. Zmiany błonowej lokalizacji białek PIN obserwowano w embriogenezie, inicjowaniu korzeni bocznych, filotaksji, a także w niektórych odpowiedziach tropowych. Wykazano, że grawistymulacja korzenia, odbierana przez komórki kolumelli, zmienia lokalizację PIN3 z apolarnej na polarną, prowadząc do asymetrycznego rozkładu auksyny w części elongacyjnej korzenia. Podobnie, odpowiedź fototropowa w postaci wygięcia hypokotyla, pozostająca w ścisłym związku z nierównomiernym rozmieszczeniem auksyny, zależna jest od polarnej lokalizacji PIN3 w komórkach endodermy.

Słowa kluczowe: auksyna, polarny transport auksyn, relokalizacja transporterów auksyn

Słowa kluczowe: komórka dendrytyczna, transplantacja, tolerancja przeszczepu